突破！David Liu开发新型单碱基编辑技术，成功治疗隐性基因突变导致的耳聋 | 医麦猛爆料

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2020年6月6日/医麦客新闻 eMedClub News/-- 美国时间6月3日，一项运用新型单碱基编辑技术以及双AAV载体递送技术，成功恢复耳聋小鼠听力的研究，发表在Science Translational Medicine 杂志上。该项研究由基因编辑大牛David Liu（刘如谦）团队完成，这是首次将基因编辑技术用于遗传性感觉障碍。

针对Tmc1基因突变的曲折研究史

早在2011年，就有研究发现Tmc1蛋白是人类听觉神经不可或缺的一部分。2015年，哈佛医学院耳鼻喉科和神经学教授 Jeffrey Holt 首次通过AAV基因疗法将完整的Tmc1的基因递送到Tmc1基因隐性突变的小鼠模型中，研究结果发现，耳聋小鼠在2个月内恢复了初级听觉。但是Jeffrey Holt教授和他的同事表示，该疗法对于这些遗传性的、深度耳聋来说，辅助效果更为明显，治疗效果并不够好，还有很多要改进的地方。

随后，2017年2月，Jeffrey Holt教授再次通过AAV递送技术，将Tmc1的功能性基因递送进小鼠内耳，并恢复了隐性耳聋小鼠的听力。但这种递送正常基因的方式，治疗的持续时间有限，并不能真正编辑修复隐性基因突变。

基于这些研究，2017年12月，David Liu团队在Nature发表论文，使用CRISPR/Cas9基因编辑技术，敲除突变Tmc1基因，保留正常Tmc1基因，成功修复了小鼠模型的显性突变并缓解了听力丧失。

然而，该疗法只对显性基因突变的耳聋小鼠有效，对于隐性基因突变的小鼠而言，必须对1个或2个突变基因进行拷贝修复，而不是进行基因敲除，这就大大增加了研究难度。

▲ David Liu（刘如谦，基因编辑领域的大牛之一）

为了解决这一问题，David Liu团队利用自己开发的单碱基编辑器（Base Editor），在体外细胞实验中能够找到隐性突变位点并成功修复Tmc1基因，细胞试验结果显示 ，经过编辑的细胞恢复了正常基因功能，存在100％的听力功能。

然而，在进行动物实验时，研究人员发现单碱基编辑器对于单个AAV基因递送载体来说太大了， 而新设计的负责基因修复的基础编辑器需要更多的空间。因此，研究小组将单碱基编辑器分为两部分，分别由两段AAV载体进行递送。单碱基编辑器进入体内后，具有基因缺陷的细胞同时感染两段AAV病毒载体，两段基因将重新结合为完整的全长序列，并前往寻找其需要修复的靶点。

通过双AAV递送策略，以及单碱基基因编辑技术的修复，小鼠试验结果显示：几乎没有可检测到的脱靶现象，小鼠体内存在完整的耳毛细胞形态和信号转导，原本完全丧失听力的小鼠能够对响亮甚至中等程度的声音作出反应。这些结果表明，小鼠至少恢复了部分听力，研究达到了突破性的治疗水平。

同时，这一结果也体现了单碱基基因编辑技术的强大，为治疗其他遗传形式的听力损失和其他遗传疾病打开了大门！

推荐阅读（关于单碱基基因编辑技术到双碱基编辑系统的发展史）：

耳聋基因治疗策略

听力丧失是最常见的感觉障碍之一，影响着世界6.8％的人口(约5亿人)。遗传性耳聋是新生儿常见的疾病，发病率大约1/1000，且80%是常染色体隐性遗传(DFNB)，20%为显性。

目前治疗听力丧失的方法有助听器、振动声桥及人工耳蜗等。对于听力丧失超出助听器帮助的患者，唯一有效的治疗选择是人工耳蜗(CI)。CI是市场上最成功的感觉假肢装置。许多报告显示，大多数耳聋患者在接受CI后可以在安静的环境中理解言语。全世界大约有30万名患者接受了人工耳蜗植入，但这仅占所有耳聋患者的一小部分。CI也有很大的局限和弱点，例如频率敏感性、言语分辨及噪声环境下的感知困难。CI是假肢装置，需要患者在其一生中非常小心地使用。因此，听力丧失需要更好的治疗策略。

▲ 图片来源：The Meducator

基因治疗已成为治疗听力丧失等遗传性疾病的潜在和有希望的策略。听力丧失作为基因治疗的潜在适应症，独特的优势：

• 耳蜗高度隔室化，并通过血液-耳蜗屏障(BCB)与身体的其他部分隔离，被认为是一种"免疫豁免器官"。这极大程度地减少了治疗所需剂量(研究成本低)，以及药物渗漏到全身循环系统的风险，以减少不良免疫反应。

• 此外，耳蜗中的毛细胞和支持细胞通常不分裂，因此耳蜗中的细胞保持稳定，有望利用非整合型病毒载体(例如AAV)进行持续的转基因表达。

因此，这引起一些机构和企业，相继展开了对耳聋基因疗法的研究和开发。

耳聋基因治疗研发进展

除了此前针对Tmc1基因突变展开的研究外，目前耳聋的基因疗法还存在以下的一些研究：

（1）2019年8月19日，权威期刊Nature Communications在线发表了一篇论文，由上海科技大学钟桂生课题组、东南大学柴人杰课题组与复旦大学附属眼耳鼻喉科医院李华伟课题组合作完成，该研究团队开发出一种新型AAV变体AAV-ie，可用于小鼠内耳中的基因递送。

其研究结果表明，AAV-ie具有安全感染小鼠耳蜗支持细胞(SCs)和毛细胞(HCs)的能力，且具有较高的感染效率，代表了对传统AAV血清型的巨大改进。考虑到部分耳聋基因主要影响SCs功能，且SCs具有再生HCs的能力，AAV-ie不仅在纠正遗传性听力损伤方面，而且在HC再生治疗环境和年龄引起的听力损失方面具有重要的潜力。

（2）2019年2月，法国科学家在PNAS上发表了一篇论文，在最新的研究中，研究人员通过称为双AAV的策略，使用了两种不同的重组AAV载体，一种携带otoferlin cDNA的5'-片段(Otof NT, 核苷酸1-2,448)，另一种携带3'-片段(Otof CT, 核苷酸2,449-5,979)，两种载体能够通过其反向末端重复重组并产生多联体，并且所得转录物可以正确剪接产生蛋白质otoferlin（又称耳铁蛋白，OTOF；是一种在耳蜗内毛细胞(IHC)突触中传递声音信息所必需的蛋白质）。

该研究中的基因治疗不仅成功地防止耳蜗正在发育的Otof -/-小鼠的耳聋，并且耳蜗完全发育后给药，也能以持续的方式逆转耳聋表型。

（3）制药巨头诺华已将其听力损失的基因疗法推进到早期临床试验，其称为CGF166的基因疗法，是一种含有编码人Atonal转录因子（Hath1）的cDNA的重组腺病毒5（Ad5）载体。该公司表示，耳毛细胞的生长受Atonal控制，该基因可作为一种“主开关”，通常在出生后关闭，而CGF166能将开关拨到“开”位置，从而刺激正常听力所需的毛细胞生长。目前，诺华正在进行该疗法的1/2期临床试验。

（4）Akouos公司目前正在推进其首款AAV基因疗法AK-OTOF进入临床开发阶段，主要用于修复由于otoferlin (OTOF)基因突变而导致的耳聋。

（5）位于波士顿的Decibel Therapeutics正在研究针对内耳中毛细胞的治疗策略，以解决先天性听力丧失或与年龄有关的平衡障碍。其治疗先天性耳聋的AAV基因疗法DB-OTO和DB-201目前处于临床前药物发现阶段。

就以上针对耳聋基因疗法进行的临床试验和药物开发而言，我们就不难发现，在基因疗法领域，腺相关病毒（AAV）已经成为基因递送载体中不可或缺的工具之一，这一技术逐渐在医药领域占据一席之地。

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参考资料：

1.https://stm.sciencemag.org/content/12/546/eaay9101/tab-pdf

2.https://www.eurekalert.org/pub_releases/2020-06/bch-gtw060320.php

3.https://www.fiercebiotech.com/research/david-liu-s-new-gene-editing-technique-restores-hearing-mice

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